寒天培地｜微生物培養に使う寒天の固形培地

寒天培地

寒天培地（かんてんばいち）は、栄養分を含む液体に寒天を加えて固めた固形の培地で、細菌やカビ、酵母などの微生物を分離・培養・計数するために使われる。寒天濃度は一般に1.5%前後に調整される。形態には、ペトリ皿に流し込んだ平板培地、試験管内で斜めに固めた斜面培地、垂直に固めた高層培地などがある。研究機関や病院の検査室に限らず、食品工場や医薬品工場の衛生検査でも日常的に使われる消耗品のひとつである。

ゼラチンから寒天へ移った経緯

19世紀後半、ロベルト・コッホの研究室では固形培地にゼラチンを使っていた。しかしゼラチンは25℃前後で融けてしまい、細菌によっては分解して液状にしてしまう。この問題を解決したのが寒天である。1881年から1882年ごろ、研究室の助手ヴァルター・ヘッセの妻ファニー・ヘッセが、家庭でジャムやゼリー作りに使っていた寒天を勧めた。これが寒天培地の始まりとされる。1887年には同じ研究室のユリウス・ペトリがガラス製の浅い皿を考案し、現在の平板培養の形ができあがった。寒天そのものは日本との縁が深い。17世紀に京都・伏見で、冬の屋外に捨てたところてんが凍って乾き、寒天ができたという逸話が伝わっている。

固まる温度と溶ける温度の差

寒天はテングサやオゴノリなどの紅藻から取り出される多糖類で、主成分はアガロースとアガロペクチンである。85～95℃で溶け、冷えると32～40℃あたりで固まる。溶ける温度と固まる温度がこれほど離れている性質はヒステリシスと呼ばれ、培地には好都合である。50℃程度まで冷ましても液体のまま扱えるので、熱に弱い血液や抗生物質を混ぜ込める。一度固まれば、37℃で培養しても崩れない。寒天を分解できる微生物がごく少ないことも、ゼラチンより優れている点である。

用途で分かれる主な種類

培地は、幅広い菌を生やす非選択培地、目的外の菌の増殖を抑える選択培地、菌の性質を集落の色で見分ける鑑別培地に大きく分けられる。実際の製品は、選択と鑑別の両方の機能を持つものが多い。現場でよく使われる培地を次の表にまとめた。

調製の流れ

研究室でも工場の検査室でも、市販の粉末培地（乾燥培地）を水に溶かして作るのが一般的である。手順は次のとおり。

1. 粉末培地を量り、精製水に加える。標準寒天培地なら1Lあたり約23.5gが目安である。
2. かき混ぜながら加熱し、寒天の粒が見えなくなるまで完全に溶かす。
3. オートクレーブを使い、121℃で15分間滅菌する。
4. 45～50℃まで冷まし、必要なら血液や抗菌剤を加える。
5. クリーンベンチ内で、直径90mmのペトリ皿に15～20mLずつ注ぎ、固まったら逆さにして保管する。

食品工場での使い分けとコスト感

食品工場の微生物検査は、HACCPに基づく衛生管理の検証という位置づけで行われることが多い。製品の検査には、検体の希釈液とまだ固まっていない培地をペトリ皿で混ぜる混釈法が使われる。国際規格ではISO 4833-1が30℃での集落数え上げの方法を定めており、1枚あたり30～300個のコロニーが数えやすい範囲とされる。設備や手指の汚れを調べるときは、培地表面を直接押し当てるスタンプ培地が手軽である。培地を自社で作るか市販品を買うかは、使う量で決まる場合が多い。1日に数枚しか使わない工場では、すぐ使える市販の平板培地のほうがオートクレーブの維持費や作業の手間を考えると割安になりやすい。毎日数百枚を使う検査センターでは、粉末から作るほうが1枚あたりの費用を大きく抑えられる。ただし自家調製では、ISO 11133の考え方に沿って、ロットごとに標準菌株が正しく生えるか確認する手間が増える。

調製でつまずきやすい点

よくある失敗は、培地が固まらないことである。寒天は酸性のまま加熱すると分解し、固まる力が弱くなる。PDAをpH3.5程度まで下げて使う場合、酒石酸などの酸は必ず滅菌後に加え、加熱は最小限にとどめる。一度固めた培地を溶かし直すのも1回までにしたい。ブドウ糖を多く含む培地を長く加熱しすぎると、茶色く色づいて菌の生え方が変わる。注いだ直後の平板はふたの内側に水滴がつきやすく、そのまま使うと水滴を伝って菌が広がり、集落が数えにくくなる。

保管方法

作った平板培地は乾燥を防ぐため袋や容器に入れ、2～8℃の冷蔵庫で光を避けて保管する。市販の平板培地は、種類にもよるが数週間から3か月ほどで期限が切れるものが多い。使う前に、表面のひび割れ、異常な色、雑菌の集落がないかを目で確認しておくと、検査の失敗を防ぎやすい。