高速液体クロマトグラフィー(HPLC)
高速液体クロマトグラフィー(HPLC)は、液体の移動相と固体あるいは化学結合した固定相との相互作用差を利用して混合物を分離し、定性・定量する分析法である。高圧ポンプで移動相を送液し、微粒子充填カラム内で成分が分配・吸着・イオン交換などの機構によって帯留し、保持時間の差として溶出する。クロマトグラム上のピーク位置と面積から成分同定と定量が可能であり、医薬品、環境、食品、材料など広範な分野で標準的手法となっている。
原理と保持挙動
固定相と移動相に対する溶質の親和性の差が保持を生む。保持時間 tR、デッドタイム t0、容量比 k'＝(tR−t0)/t0 を基礎指標とし、選択性 α と理論段数 N により分離度 Rs が決まる。ピーク対称性はテーリングファクターで評価し、過度な二次相互作用や活性点があると尾引きが発生する。流速、温度、溶媒強度、pH、イオン強度などが保持と選択性を左右するため、条件最適化が重要である。
装置構成
一般的なシステムは高圧送液、試料導入、分離、検出、データ処理の各要素で構成される。高圧配管の固定では継手やフェルールに加え、筐体や治具の締結でねじやボルトが用いられる場合もある。
- ポンプ：等濃度（アイソクラティック）およびグラジエントの送液を行う。
- インジェクタ／オートサンプラ：一定体積の試料を再現よく導入する。
- カラム：シリカ系やポリマー系の微粒子を充填した心臓部。
- 検出器：UV、DAD、FL、RI、ELSD、MS など目的に応じて選択する。
- 脱気器／ミキサ：溶存ガス除去と溶媒混合の安定化を担う。
分離モードの種類
分離機構に応じて複数のモードが存在する。最も汎用なのは逆相であり、疎水性相互作用により広範な有機化合物を扱える。極性化合物には順相や HILIC、電解質にはイオン交換、巨大分子にはサイズ排除が有効である。キラル固定相を用いれば光学分割も可能である。
- 逆相：C18 などの ODS を固定相とし、極性の高い移動相で分離。
- 順相：シリカやアミノ相で極性溶媒系を用いる。
- イオン交換：官能基の電荷相互作用を利用。
- サイズ排除（SEC）：分子ふるい効果で高分子やタンパク質を分画。
- HILIC／キラル：親水性相やキラル選択性で難分離物を扱う。
移動相とグラジエント設計
移動相には水系緩衝液と有機溶媒（アセトニトリル、メタノールなど）を用いる。pH と緩衝能は解離性化合物の保持を支配し、イオン対試薬は弱酸・弱塩基の保持制御に有効である。グラジエントは溶媒強度を時間で変化させ、幅広い極性成分の分離時間短縮とピーク形状改善に寄与する。脱気と溶媒のろ過はベースライン安定化に不可欠である。
検出法の選択
UV/Vis は感度・頑健性に優れ汎用である。DAD は多波長・スペクトル同定が可能、蛍光（FL）は高感度だが蛍光特性が必要、屈折率（RI）は普遍検出だがグラジエントに不向き、ELSD は不揮発性成分に有効である。MS は選択性・感度に優れ、LC-MS により微量不純物の同定や代謝物解析が可能である。
定量法とシステム適合性
定量は外部標準法、内部標準法、検量線法を用い、直線性、精度、真度、LOD/LOQ を検証する。システム適合性では N、Rs、テーリングファクター、再現性（%RSD）などを規定し、インジェクタのキャリーオーバーやブリードの確認を行う。安定同位体内標準はマトリクス影響の補正に有効である。
最適化と Van Deemter 式
理論段高さ H は Van Deemter 式 H＝A＋B/u＋C·u で表され、粒子径、拡散、物質移動抵抗が分離効率を決める。u の最適値付近で操作すると効率が最大化する。粒子径の微細化とカラム長の適正化により高解像度を得られるが、背圧が増大するため UHPLC（サブ 2 µm、耐圧 100 MPa 級）の適用では配管死容積の最小化と装置剛性が重要である。
応用分野
医薬品原薬・製剤の純度試験、ジオメトリ異性体や関連物質の管理、バイオ医薬のペプチドマッピングや糖鎖解析、食品中の添加物・残留農薬のスクリーニング、環境水中の微量汚染物質の監視、ポリマーの分子量分布評価などに幅広く用いられる。固相抽出などの前処理と組み合わせることで微量分析の堅牢性が高まる。
トラブルシューティング
ベースラインドリフトは溶媒の吸収差や温度不安定、脱気不良が原因であることが多い。テーリングはカラム活性点や過負荷、pH 不適合が一因で、エンドキャッピング相やイオン対の利用で改善する。圧力上昇はフィルターやガードカラムの閉塞、析出物の付着が典型で、前処理強化と定期的交換で予防する。ゴーストピークは溶媒不純物やブリード由来で、ブランク注入や溶媒等級の見直しが有効である。
安全・環境面の留意
高圧・有機溶媒を扱うため、耐溶剤手袋、防護眼鏡、換気を徹底する。廃液は水系と有機系を分別し、ハロゲン化溶媒は専用回収とする。リークは火災と健康被害のリスクがあるため、継手の適切な締付と定期点検、シール材の劣化管理を行う。記録・監査の観点ではメソッドとロット、カラム履歴、システム適合性結果を追跡可能に保管することが求められる。